De todos modos hacerlo en PNG permite otras cosas, como no tener que setear un color transparente ni uno translúcido, podemos manejar la transparencia a nuestro antojo (más fácil de subir o bajar la transparencia una vez que el tileset ya fue guardado) y no tiene artifacts (JPG tiene artifacts, nunca debería ser usado para esto)
Por otro lado, usar Photoshop permite cosas muy interesantes, como hacer copias del mismo tile con diferentes colores, hacer una cuadrícula de tileset fácilmente para insertar sin errores, entre otras cosas que tocará descubrir uno mismo.